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» » » Químicos resuelven una parte fundamental del funcionamiento celular

Referencia Phys.org , 27 de agosto 2015
"Chemists solve major piece of cellular mystery"
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No está permitido que entre cualquier cosa en el núcleo, el corazón de las células eucariotas, donde, entre otras cosas, se almacena la información genética. Una membrana doble, llamada envoltura nuclear, actúa como un muro, protegiendo los contenidos del núcleo. Cualesquiera moléculas que traten de entrar o salir del núcleo deben hacerlo a través de un controlador de acceso celular, conocido como complejo de poro nuclear (CPN), o poro, que existe dentro de la envoltura.

Un equipo de bioquímicos, dirigidos por André
Hoelz de Caltech, ha resuelto la arquitectura
del complejo anillo interior del poro nuclear,
un subcomplejo fundamental para que la
capacidad de la máquina celular sirva como
barrera y facilitador de transporte.
Crédito: Lance Hayashida/
Caltech and the Hoelz Laboratory/ Caltech
¿Que hace del CPN un eficaz guardián de acceso, previniendo la entrada en el núcleo mientras que ayuda al transporte de ciertas moléculas a través de la envoltura nuclear? Los científicos han estado tratando de averiguarlo desde hace décadas, al menos en parte, dado que el NPC es la diana de una serie de enfermedades, incluyendo algunas formas agresivas de leucemia y de los trastornos del sistema nervioso, como una forma hereditaria de la enfermedad de Lou Gehrig. Ahora, un equipo liderado por André Hoelz, profesor asistente de bioquímica en Caltech, ha resuelto la pieza crucial de este rompecabezas.


En febrero de este año, Hoelz y sus colegas publicaron un artículo que describe la estructura atómica de la compleja capa nucleoporina del NPC, un subcomplejo que forma lo que ahora llamamos anillos externos (ver ilustración). Sobre la base de ese trabajo, el equipo ha resuelto la arquitectura de anillo interno del poro, un subcomplejo que es fundamental para que el NPC pueda servir como barrera y  facilitador de transporte. A fin de determinar esa arquitectura, la cual determina cómo las proteínas del anillo interactúan entre sí, los bioquímicos construyeron el complejo en un tubo de ensayo y luego los disecaron sistemáticamente para entender las interacciones entre los componentes individuales. Más tarde validaron que así es cómo realmente funciona en vivo, en una especie de hongo.

Durante más de una década, otros investigadores han sugerido que el anillo interno es muy flexible y se expande, para permitir el paso de grandes macromoléculas a su través. "Se han propuesto algunos modelos complicados intentando explicar cómo esto podría suceder", apunta Hoelz. Pero ahora él y sus colegas, han demostrado que estos modelos son incorrectos y que estas supuestas dilataciones simplemente no ocurren.

"Usando un enfoque interdisciplinario, hemos resuelto la arquitectura de este subcomplejo y hemos demostrado que no cambia de forma significativa", explica Hoelz. "Es un andamio relativamente rígido incorporado en el poro y, básicamente, se asienta como una decoración, como pompones en una bicicleta. No puede dilatarse."

El nuevo documento aparece en línea del 27 de agosto en la revista Science Express. Los cuatro coautores principales del artículo son los posdoctorados de Caltech, Tobias Stuwe, Christopher J. Bley, y Karsten Thierbach, y el graduado Stefan Petrovic.

Este video cuenta con una estructura de cristal tridimensional de rotación. Crédito: Andre Hoelz / Caltech y Ciencia

Juntos, los anillos interno y externo, constituyen el núcleo simétrico de NPC, una estructura que incluye 21 proteínas diferentes. El núcleo simétrico se llama así debido a su simetría radial (los dos subcomplejos restantes del NPC son específicos, ya sea el que mira hacia el citoplasma de la célula o el que mira hacia el núcleo, por tanto no son simétricos). Tras haber resuelto la estructura de la capa del complejo nucleoporina y localizarlos en los anillos exteriores, los investigadores sabían que el resto de componentes que no están anclados a la membrana deben compensar al anillo interno.

Empezaron a resolver la arquitectura al centrarse en el canal del complejo nucleoporina, o canal, que recubre el canal de transporte central y se compone de otras tres proteínas, lo que representa alrededor de la mitad del anillo interno. Este complejo produce estructuras filamentosas que sirven como sitios de atraque para proteínas específicas que transportan moléculas a través de la envoltura nuclear.

Los bioquímicos emplearon bacterias para fabricar proteínas asociadas con el anillo interno en un tubo de ensayo y fue mezclado en varias combinaciones hasta construir toda el subcomplejo. Una vez reconstituido éste, pudieron modificarlo para investigar cómo se mantiene unido y cuáles de sus componentes son críticos, y determinar cómo está conectado el canal para el resto del poro.

Arquitectura del anillo interno del NPC  propuesto por el equipo liderado por Caltech. Crédito: Hoelz Laboratorio / Caltech

Hoelz y su equipo, encontraron que el canal está unido por un solo sitio. Esto significa que no se puede estirar de manera significativa debido a que tales cambios en su forma requerirían múltiples puntos de unión. Hoelz señala que un nuevo estudio de microscopía electrónica de NPC, publicado en 2013, por el grupo de Martin Beck en el European Molecular Biology Laboratory (EMBL) en Heidelberg, Alemania, indicó que el canal central es más grande de lo que se pensaba y lo suficientemente amplio para dar cabida incluso el más grande cargas conoce para pasar a través del poro.

Cuando los investigadores introdujeron mutaciones que eliminan eficazmente la fijación única del canal, el complejo ya no pudo ser incorporado en el anillo interior. Después de probar esto en el tubo de ensayo, también demostraron su certeza en las células vivas.

"Todo este complejo es una máquina muy complicada de montar. Lo interesante aquí es que la naturaleza ha encontrado una manera elegante de esperar hasta el final de la unión del poro nuclear para incorporar el canal", resalta Hoelz. "Al incorporar este canal, se establecen dos cosas a la vez: se forma inmediatamente una barrera y se genera la capacidad de regular el transporte que se produzca a través del poro". Antes de la incorporación del canal, había simplemente un agujero a través del cual las macromoléculas podían pasar libremente.

A continuación, Hoelz y sus colegas utilizaron cristalografía de rayos X para determinar la estructura del canal del subcomplejo de nucleoporina enlazando al adaptador de nucleoporina Nic96, cuyo único sitio es adjunto al poro nuclear. En la cristalografía de rayos X se aplican rayos X sobre una muestra cristalizada y se analiza el patrón de los rayos reflejados por los átomos en el cristal. Dado que el NPC es una grande y compleja máquina molecular, que también tiene muchas partes móviles, ellos usaron un anticuerpo diseñado esencialmente para "pegar" muchas copias del complejo en su lugar y formar una muestra cristalina bien ordenada. Luego se analizaron cientos de muestras utilizando el Observatorio Molecular de Caltech (unas instalaciones desarrolladas con el apoyo de la Fundación Gordon y Betty Moore), que incluye una línea de haz de rayos X automatizada en el Laboratorio Sincrotrón de Radiación de Stanford, que se puede controlar de forma remota desde Caltech, y el haz de GM/CA de la Advanced Photon Source en el Laboratorio Nacional de Argonne. Eventualmente, fueron capaces de determinar el tamaño, la forma y la posición de todos los átomos del canal subcomplejo de nucleoporina y su ubicación dentro del NPC.

Los investigadores también resolvieron una serie de estructuras cristalinas de otras partes del NPC, y determinaron la forma en que éstas interactúan con los componentes del anillo interno. Al hacerlo, demostraron que uno de estas interacciones es crítica para el posicionamiento del canal en el centro del anillo interno. Hallaron, además, que se necesita de un posicionamiento exacto para la exportación adecuada desde el núcleo de mRNA y los componentes de los ribosomas, los complejos que hacen proteínas de la célula, permitiendo el flujo fundamental de la información genética del ADN al mARN a la proteína.

En última instancia, a Hoelz le gustaría entender cómo funciona el NPC con gran detalle, a fin de poder generar terapias para las enfermedades asociadas con la disfunción de este complejo. También sueña con la creación un poro completo en el tubo de ensayo y así estudiarlo plenamente y entender lo que sucede, ya que se ha modificado de varias maneras. "Igual que cuando dije que quería resolver la estructura atómica del poro nuclear, también dirán que estoy loco por tratar de hacer esto", dice. "Pero si no lo hacemos, es probable que nadie más lo haga."

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Publicacion: Architecture of the fungal nuclear pore inner ring complex, Science.
Fuente: California Institute of Technology

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